How important are Rho GTPases in neurosecretion?

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Phospholipid Scramblase-1-Induced Lipid Reorganization Regulates Compensatory Endocytosis in Neuroendocrine Cells

Calcium-regulated exocytosis in neuroendocrine cells and neurons is accompanied by the redistribution of phosphatidylserine (PS) to the extracellular space, leading to a disruption of plasma membrane asymmetry. How and why outward translocation of PS occurs during secretion are currently unknown. Immunogold labeling on plasma membrane sheets coupled with hierarchical clustering analysis demonstrate that PS translocation occurs at the vicinity of the secretory granule fusion sites. We found that altering the function of the phospholipid scramblase-1 (PLSCR-1) by expressing a PLSCR-1 calcium-insensitive mutant or by using chromaffin cells from PLSCR-1−/−mice prevents outward translocation of PS in cells stimulated for exocytosis. Remarkably, whereas transmitter release was not affected, secretory granule membrane recapture after exocytosis was impaired, indicating that PLSCR-1 is required for compensatory endocytosis but not for exocytosis. Our results provide the first evidence for a role of specific lipid reorganization and calcium-dependent PLSCR-1 activity in neuroendocrine compensatory endocytosis

Dynamique des lipides au cours du cycle d'exo-endocytose dans les cellules neuroendocrines : rôle des protéines Rac1 et Scramblase

L'exocytose régulée est un processus cellulaire essentiel qui permet aux cellules d'assurer leurs fonctions spécifiques en sécrétant une multitude de signaux chimiques tels que les neurotransmetteurs, les hormones, les cytokines ou encore les facteurs de croissance. Dans les cellules neuroendocrines, l'exocytose régulée par le calcium se décompose en plusieurs étapes : le recrutement des granules de sécrétion contenant les hormones vers la périphérie cellulaire, leur arrimage au site d'exocytose de la membrane plasmique et la fusion entre les membranes plasmique et granulaire aboutissant à la libération de leur contenu dans le milieu extracellulaire. Afin de maintenir une surface cellulaire constante, l'exocytose est suivie d'une endocytose dite compensatrice. Ce processus essentiel assure le réapprovisionnement de la population granulaire et permet ainsi une libération hormonale pérenne au cours du temps. De nombreuses études mettent en évidence l'implication de différentes protéines au cours du trafic des granules de sécrétion telles que les protéines SNARE, diverses GTPases ainsi que le cytosquelette d'actine et ses régulateurs. De plus, des données récentes soulignent également l'importance du rôle des lipides. En étudiant la fonction de la GTPase Rac1 et de la Scramblase, j ai pu mettre en évidence, au cours de mon doctorat, deux voies de régulation de l'acide phosphatidique (PA) et de la phosphatidylsérine (PS) lors de la libération hormonale dans les cellules neuroendocrines. Dans un premier temps, mes résultats montrent l'existence d'une cascade moléculaire impliquant Scribble, bPix et Rac1 aboutissant à la synthèse de PA au niveau des sites d'exocytose via l'activation de la phospholipase D. Ce phospholipide, en forme de cône, jouerait un rôle dans les étapes tardives en favorisant des courbures de membranes nécessaires à la fusion entre les membranes granulaire et plasmique. Ces données mettent en lumière, pour la première fois, un lien direct entre Rac1 et la fusion membranaire. L'organisation lipidique de la membrane plasmique est naturellement asymétrique et certains phospholipides comme la PS sont concentrés sur le feuillet interne de la membrane plasmique. Or cette asymétrie membranaire est rompue au cours de l'exocytose et la PS est exposée sur la face externe de la membrane plasmique. Au cours de la seconde partie de ma thèse, je me suis intéressée à la régulation et au rôle de ce transport de PS. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence que la protéine scramblase est à l'origine de ce mécanisme. De façon intéressante, j ai pu montrer que l'externalisation de PS n est pas indispensable à l'exocytose des granules per se mais à l'endocytose compensatrice qui lui fait suite.Exocytosis is a ubiquitous and fundamental process governing many cellular and physiological reactions including hormone and neurotransmitter release, cell migration, membrane repair and proliferation. In neuroendocrine cells, the release of hormones and neuropeptides occurs through a calcium-regulated exocytotic process of large dense-core secretory granules. This process is divided in different steps including recruitment of the granule to the cell periphery, docking at the exocytotic sites and fusion with the plasma membrane. To allow secretory vesicle recycling and maintain a constant cell surface area, exocytosis must be followed by compensatory membrane uptake. Many proteins have been implicated in granule trafficking such as SNARE proteins, GTPases or the actin cytoskeleton and recently, lipids have emerged as an important actor in this process. During my PhD, I have studied the role of two proteins, the Rho GTPase Rac1 and the Scramblase during secretory granule trafficking and shown their involvement into the regulation of two phospholipids dynamics: phosphatidic acid (PA) and phosphatidylserine (PS). First, I have shown that secretagogue-evoked activation of phospholipase D1 (PLD1) at the plasma membrane is regulated by a molecular pathway including Scrib, bPix and Rac1. Activation of PLD1 leads to the production of PA which could participate in the fusion process between granule and plasma membrane. Altogether, our findings define a novel molecular pathway, linking for the first time Rac1 to the final stages of Ca2+-regulated exocytosis in secretory neuroendocrine cells. Plasma membrane displays a specific asymmetric lipid distribution. For example, PS resides in the inner cytoplasmic leaflet. Interestingly, disruption of the asymmetry has been observed during the secretory process and PS is transiently translocated to the cell surface. During the second part of my thesis, I focused my attention on the regulation and the role of the secretagogue-evoked PS translocation. Our results demonstrate that the outward transport of PS at the exocytotic site is mediated by the calcium-dependent lipid translocase Scramblase and that this process is essential for compensatory endocytosis

Dynamique des lipides au cours du cycle d'exo-endocytose dans les cellules neuroendocrines : rôle des protéines Rac1 et Scramblase

L'exocytose régulée est un processus cellulaire essentiel qui permet aux cellules d'assurer leurs fonctions spécifiques en sécrétant une multitude de signaux chimiques tels que les neurotransmetteurs, les hormones, les cytokines ou encore les facteurs deExocytosis is a ubiquitous and fundamental process governing many cellular and physiological reactions including hormone and neurotransmitter release, cell migration, membrane repair and proliferation. In neuroendocrine cells, the release of hormones an

Politiques institutionnelles des responsables légaux impliqués lors des recherches biomédicales se déroulant dans des pays à faibles ressources : quelle place pour les soins auxiliaires ?

Les recherches biomédicales possèdent un champ d’action international rendant l’application des standards éthiques internationaux complexe du fait de contextes culturels et économiques variés. Lorsque ces recherches se déroulent dans des pays à très faibles ressources, la « protection de la santé et du bien-être » des participants aux recherches, notion fondamentale en éthique de la recherche, soulève plusieurs enjeux. Dans ce cadre, les soins auxiliaires sont définis par des soins apportés aux participants n’étant pas nécessaires afin d’assurer la validité scientifique de la recherche, la sécurité des participants ou de compenser les dommages causés par celle-ci. Cette problématique, bien que confidentielle en éthique de la recherche, soulève de nombreux enjeux. Nous nous sommes intéressés dans ce travail au positionnement institutionnel en termes d’éthique de la recherche et de soins auxiliaires d’acteurs primordiaux de la recherche : leurs responsables légaux. Ce travail a permis d’élaborer une cartographie des essais cliniques se déroulant dans les pays où l’accès aux soins essentiels est le plus faible. Les responsables légaux ont été identifiés et leurs politiques institutionnelles en termes d’éthique de la recherche et de soins auxiliaires ont été analysées. Le nombre d’essais cliniques répertoriés dans ces territoires est faible, inférieur à 1% des essais cliniques mondiaux. Les responsables légaux sont majoritairement des institutions publiques externes aux pays hôtes. L’analyse des politiques institutionnelles a montré que seulement 36% font référence à l’éthique de la recherche et seulement 6% abordent la problématique des soins auxiliaires et de façon indirecte. L’analyse de 3 protocoles de recherche a cependant permis de mettre en évidence que la mise en place de soins auxiliaires se faisait concrètement. La problématique des soins auxiliaires, bien que confidentiels, est un enjeu important qui mériterait d’être plus étudié dans un contexte de recherche en santé mondialisé

αII‐spectrin controls calcium‐regulated exocytosis in neuroendocrine chromaffin cells through neuronal Wiskott–Aldrich Syndrome protein interaction

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The F-Actin Binding Protein Cortactin Regulates the Dynamics of the Exocytotic Fusion Pore through its SH3 Domain

Upon cell stimulation, the network of cortical actin filaments is rearranged to facilitate the neurosecretory process. This actin rearrangement includes both disruption of the preexisting actin network and de novo actin polymerization. However, the mechanism by which a Ca2+ signal elicits the formation of new actin filaments remains uncertain. Cortactin, an actin-binding protein that promotes actin polymerization in synergy with the nucleation promoting factor N-WASP, could play a key role in this mechanism. We addressed this hypothesis by analyzing de novo actin polymerization and exocytosis in bovine adrenal chromaffin cells expressing different cortactin or N-WASP domains, or cortactin mutants that fail to interact with proline-rich domain (PRD)-containing proteins, including N-WASP, or to be phosphorylated by Ca2+-dependent kinases, such as ERK1/2 and Src. Our results show that the activation of nicotinic receptors in chromaffin cells promotes cortactin translocation to the cell cortex, where it colocalizes with actin filaments. We further found that, in association with PRD-containing proteins, cortactin contributes to the Ca2+-dependent formation of F-actin, and regulates fusion pore dynamics and the number of exocytotic events induced by activation of nicotinic receptors. However, whereas the actions of cortactin on the fusion pore dynamics seems to depend on the availability of monomeric actin and its phosphorylation by ERK1/2 and Src kinases, cortactin regulates the extent of exocytosis by a mechanism independent of actin polymerization. Together our findings point out a role for cortactin as a critical modulator of actin filament formation and exocytosis in neuroendocrine cells

Selective recapture of secretory granule components after full collapse exocytosis in neuroendocrine chromaffin cells.

In secretory cells, calcium-regulated exocytosis is rapidly followed by compensatory endocytosis. Neuroendocrine cells secrete hormones and neuropeptides through various modes of exo-endocytosis, including kiss-and-run, cavicapture and full-collapse fusion. During kiss-and-run and cavicapture modes, the granule membrane is maintained in an omega shape, whereas it completely merges with the plasma membrane during full-collapse mode. As the composition of the granule membrane is very different from that of the plasma membrane, a precise sorting process of granular proteins must occur. However, the fate of secretory granule membrane after full fusion exocytosis remains uncertain. Here, we investigated the mechanisms governing endocytosis of collapsed granule membranes by following internalization of antibodies labeling the granule membrane protein, dopamine-β-hydroxylase (DBH) in cultured chromaffin cells. Using immunofluorescence and electron microscopy, we observed that after full collapse, DBH remains clustered on the plasma membrane with other specific granule markers and is subsequently internalized through vesicular structures composed mainly of granule components. Moreover, the incorporation of this recaptured granule membrane into an early endosomal compartment is dependent on clathrin and actin. Altogether, these results suggest that after full collapse exocytosis, a selective sorting of granule membrane components is facilitated by the physical preservation of the granule membrane entity on the plasma membrane